技术分享14｜速普（SuPro Instruments)｜Coolglow辉光放电仪Demo机器使用心得

辉光放电一般是指低气压放电现象,工作压力一般都低于10 mbar。其基本构造是在封闭的容器内放置两个平行的电极板,利用产生的电子将中性原子或分子激发,而被激发的粒子由激发态降回基态时会以光的形式释放出能量。在激发状态下构成分子的原子获得足够大的的动能，开始彼此分离，原子的外层电子摆脱原子核的束缚成为自由电子，失去电子的原子变成正离子。这一过程叫电离，形成的等离子体是一种电离气体。

等离子表面处理可以实现很多功能，例如超洁净清洗、表面能改善、表面活化、刻蚀、涂覆等。TEM样品前处理设备亲水化处理仪或者称为辉光放电仪就是利用这一技术实现对TEM碳膜进行表面改性，以获取更佳的制样效果。

是空气进行等离子处理时，辉光放电将氧气变成等离子态，中性的氧气的变成带电粒子（有正电荷，也有负电荷），这些高能粒子轰击物体表面，会暂时使得样品表面富集负电荷从而提高样品表面能，这就改变物体表面的性质。 

经过亲水化处理的载网表面亲水性加强，溶液会在其表面摊成一层弧度较小的均匀的溶液膜，而非一滴球滴（图2），在后续经过滤纸吸取多余液体后在载网内才会形成厚度均匀的冰层（图3）。

Coolglow是速普于2020年推出的一款简单高效的辉光放电仪（图4）。该仪器使用高性能机械泵可以产生一个洁净的＜10pa的真空压强，通常抽真空时间小于1分钟。采用恒功率 RF 射频电源，可重复性高。感应射频放电模式也大幅降低等离子体对样品的热影响和离子轰击损伤。特别适用于对温度或轰击敏感的 TEM 或 SEM 生物样品进行清洗、表面活化、亲水化等用途。（来自速普官网介绍）

本机器为速普公司送给我高峰电镜中心使用的Demo机器，并在第一届上海市高峰电镜中心冷冻电镜研讨会中用于上机的培训使用。在开始使用该仪器之前，结合工程师建议和我们之前的经验，我们最初设置参数为功率30W、气压40Pa、辉光时间50s。使用了约一周左右，发现载网相较之前更频繁的出现破裂的情况（图5），在使用镍钛合金载网时候，square中间出现裂口、裂纹的现象会更多。虽然总体不影响使用，但是对载网的利用率还是带来一定影响。

随后我们更改参数为功率30W、气压60Pa、辉光时间40s，到目前为止，随着辉光时间的减少，载网的破裂频率有所下降，大部分Square所表现出来的冰层都较均一（图6）。但是同时，一些区域的冰层较厚（图7橙色区域）和Square中央有大块黑色覆盖（图8红色区域）的square数量也会增多，尤其是对一些可溶性蛋白进行制样检查时，这种现象会更频繁（图9），这个现象表明亲水化力度不够，这将影响了载网的利用效率和数据收集效率。

继续和工程师交流后，工程师建议我们采用功率20-25W、提高真空度、增加亲水化时间进行亲水化。由于腔室真空度提高，上述“Square中央有大块黑色覆盖”问题较为改善（图10），对于可溶性小分子量的蛋白，偶尔会出现此现象。‍‍‍

后续我们会总结更多实例，探索不同样品和不同载网受亲水化条件的影响。

1.    Coolglow操作便利，一键式操作对用户非常友好，抽真空时间较快，能够快速有效的完成载网亲水化处理。

2.    相较我们之前使用的Peico Easiglow，操作上都很容易上手，但Peico Easiglow的玻璃罩比较容易受损，影响气密性，导致辉光失败。使用 Coolglow时需要将腔室内真空提高一些，这样有助于更好的亲水化。‍‍‍‍

3.    Easiglow辉光放电过程中容易出现大的火花，Coolglow的辉光比较均一。

4.    使用了金网碳膜、金网金膜、镍钛合金膜、铜网碳膜几种型号的Grid，在相同的条件并，除了镍钛合金载网容易发生裂纹外，其他没有发现明显的区别。

5.    GPCR膜蛋白、离子通道大多可以得到厚度均匀的冰层；可溶性蛋白在相同条件下表现稍差，排除square中间“厚黑”冰层外，其他冰层厚度合适的holes也能满足数据收集需要；对于可溶性小分子，出现厚度不均一的冰也是正常现象。

6.    感谢速普公司提供的demo机器，在demo的几个月的时间内已经解析出多个结构膜蛋白和可溶性蛋白，目前分辨率集中在3埃以内（最好分辨率已经接近2埃），在功能上可以替代其他同类产品。

7.    我们中心目前还添置了一台低真空镀膜仪——徕卡ACE200，后续我们中心将继续记录分析不同亲水化仪器之间的区别。 

文字图片｜胡雯\吴凯\袁青宁

编辑排版｜吴凯

审核｜胡雯\吴凯\袁青宁